Difference between revisions of "C4Dマイクロチップ電気泳動の原理および使用方法"

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(Sequencer ソフトウェア)
(Gated Injectionsの注意点)
 
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eDAQ マイクロチップ電気泳動キットには多くのコンポーネントとケーブルが含まれています。次の手順に従ってください。  
 
eDAQ マイクロチップ電気泳動キットには多くのコンポーネントとケーブルが含まれています。次の手順に従ってください。  
 
# まず、パッキングリストに記載した品目が全て揃っているか確認してください。
 
# まず、パッキングリストに記載した品目が全て揃っているか確認してください。
# コンピュータに Sequencer ソフトウェアと PowerChrom ソフトウェアをインストールします。インストールしたバージョンが最新バージョンなのか edaq.com/software_dnloads.html で確認してください。
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# コンピュータに Sequencer ソフトウェアと PowerChrom ソフトウェアをインストールします。インストールしたバージョンが最新バージョンなのか edaq.com/software_downloads.html で確認してください。
 
# 操作マニュアルに従って、高電圧シーケンサ(HVS)をUSB ケーブルでコンピュータに接続します。但し電源は未だ入れないでください
 
# 操作マニュアルに従って、高電圧シーケンサ(HVS)をUSB ケーブルでコンピュータに接続します。但し電源は未だ入れないでください
 
# 同様に、C4Dデータシステムをマニュアルに従いUSBケーブルでコンピュータにつなぎます。電源は入れない事。
 
# 同様に、C4Dデータシステムをマニュアルに従いUSBケーブルでコンピュータにつなぎます。電源は入れない事。
 
# HDMI ケーブルを使って、チッププラットフォームをC4Dデータシステムにつなぎます。
 
# HDMI ケーブルを使って、チッププラットフォームをC4Dデータシステムにつなぎます。
 
# 表1に従って、カラーで識別した高電圧ケーブルを使ってチッププラットフォームをHVSに接続します。
 
# 表1に従って、カラーで識別した高電圧ケーブルを使ってチッププラットフォームをHVSに接続します。
#* 黒色の HVS ケーブルは2本あるますので必ず正しい方をつないでください。45 mm マイクロチップを使っている場合は、プラットフォーム中央部の黒色ケーブルを使います。
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#* 黒色の HVS ケーブルは2種類ありますので必ず正しい方をつないでください。45 mm マイクロチップを使っている場合は、プラットフォーム中央部の黒色ケーブルを使います。
 
#* チッププラットフォームと HVS 間はインターロックケーブルで接続します。注:カバープレートがプラットフォームから持ち上がっている場合は、インターロックがかかり電源は入りません。絶対にインターロックケーブルを迂回させないこと。
 
#* チッププラットフォームと HVS 間はインターロックケーブルで接続します。注:カバープレートがプラットフォームから持ち上がっている場合は、インターロックがかかり電源は入りません。絶対にインターロックケーブルを迂回させないこと。
 
# チップホルダーは必ずアースを取り、シグナルのノイズを抑えます。緑のグランドケーブルを使ってチッププラットフォームのグランドコネクターと C4D データシステム後部の緑のコネクターとをつなぎます。同様に、もう一本のグランドケーブルで C4D システムの緑のコネクターと HVS 後部の緑のコネクターとをつなぎます。{{#ev:youtube|YTYRjUbCRgk|300|right|Video 2. HV シーケンサーからPowerChromソフトウェアをトリガーする設置法}}
 
# チップホルダーは必ずアースを取り、シグナルのノイズを抑えます。緑のグランドケーブルを使ってチッププラットフォームのグランドコネクターと C4D データシステム後部の緑のコネクターとをつなぎます。同様に、もう一本のグランドケーブルで C4D システムの緑のコネクターと HVS 後部の緑のコネクターとをつなぎます。{{#ev:youtube|YTYRjUbCRgk|300|right|Video 2. HV シーケンサーからPowerChromソフトウェアをトリガーする設置法}}
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=== Sequencer ソフトウェア ===
 
=== Sequencer ソフトウェア ===
 
# Sequencerソフトウェアを開きOnlineモードにします。  
 
# Sequencerソフトウェアを開きOnlineモードにします。  
# 陽イオン分離測定には表2を、陰イオンの分離測定には表3に従ってシークンスセットアップします。何れFloating Injection法を用います。
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# 陽イオン分離測定には表2を、陰イオンの分離測定には表3に従ってシークンスセットアップします。何れもFloating Injection法を用います。
  
  
[[File:2. Floating Injectionによる陽イオン分離測定用のシークンス.jpg|900px|thumb|center|Table 2. Sequence for separating cations using a Floating Injection]]
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[[File:Table 2. Sequence for separating cations using a Floating Injection.jpg|900px|thumb|center|2. Floating Injectionで陽イオンを分離測定]]
[[File:3. Floating Injectionによる陰イオン分離測定用のシークンス.jpg|900px|thumb|center|Table 3. Sequence for separating anions using a Floating Injection]]
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[[File:Table 3. Sequence for separating anions using a Floating Injection.jpg|900px|thumb|center|3. Floating Injectionで陰イオンを分離測定]]
  
=== PowerChrom Software and Pipetting Solutions ===
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=== PowerChromソフトウェアと溶液の充填 ===
# Ensure the PowerChrom software is open.
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# PowerChrom ソフトウェアを開く
# In the Easy Access window, click Manual Run.
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# Easy Accessウィンドウの<Manual Run>をクリック
# In the Manual Sampling window, click Inject Settings and select Wait for Inject (Start recording immediately) and OK.
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# Manual Sampling ウィンドウの<Inject Settings>をクリックし、<Wait for Inject>を選び <OK> (<Start>を選ぶと直ちに記録を開始)
# In the Manual Sampling window, enter Stop sampling 2.00 min after Inject.
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# Manual Sampling ウィンドウで Stop sampling 2.00 min after Injectに設定
# Click Hardware Settings. Enter the following settings and then OK:
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# <Hardware Settings>をクリックし、以下を設定しOK:
 
#* Sampling speed = 100/s
 
#* Sampling speed = 100/s
 
#* Channel 1: Input = Input 1, Range = 50 mV
 
#* Channel 1: Input = Input 1, Range = 50 mV
 
#* Channel 2: Input = Off
 
#* Channel 2: Input = Off
# Click C4D Amplifier and enter the following settings:
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# <C4D Amplifier>をクリックし以下を設定:
 
#* Low Pass = 5 Hz  
 
#* Low Pass = 5 Hz  
#* In Offset, click Zero
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#* Offsetで <Zero>をクリック
# Dilute the sample from 1 mM to 100 µM with deionised water. [[File:Figure 3. Pipetting solutions into the microchip reservoirs.jpg|300px|thumb|right|Figure 3. Pipetting solutions into the microchip reservoirs]]
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# サンプル1 mM をイオン交換水で100 µM に希釈[[File:Figure 3. Pipetting solutions into the microchip reservoirs.jpg|300px|thumb|right|3.マイクロチップリザーバへの溶液の分注]]
# Pipette 50 µL of the BGE into Reservoir 4. It should take less than one second for capillary action to fill the channel with the solution. This can be confirmed by observing a change in conductivity in the C4D signal.
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# リザーバ4にBGEを50 µL分注する。毛細管現象により1秒足らずでチャネルに溶液が充填されます。充填するのをC4Dシグナルの電導度の変化で確認します。 
#* Keep the pipette vertical while pipetting solutions into the reservoirs.
+
#* リーザーバに溶液を分注する間はピペットを垂直に保ったままの状態にします。
#* Make sure that the pipette tip gently touches the sloping walls of the reservoir, as you deliver the solution. This will prevent the formation of an air bubble at the bottom of the reservoir.
+
#* この時ピペットをリザーバの傾斜壁に軽く当てながら溶液を分注してください。リザーバの底に気泡が入るのを防ぐ為です。
#* Use different pipette tips when transferring the BGE and the sample to the reservoirs, and when removing solutions from the reservoirs. This will avoid contaminating the solutions.
+
#* BGEやサンプルを分注する時とリザーバから溶液を取り除く際はピペットチップを交換してください。溶液のコンタミを防ぐ為です。
# In the PowerChrom software:
+
# PowerChromソフトウェア:
#* If you already know the C4D settings for Frequency, Amplitude and Headstage Gain, then enter these values now in the C4D Amplifier window, or
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#* 予めC4Dの設定条件が判っている時は、C4DのAmplifierウィンドウで<Frequency>、<Amplitude>、<Headstage Gain>を設定するか、
#* If you don’t know the C4D settings, use the C4D Profiler to optimise the C4D settings, as described in a separate application note. This must be done with BGE in the channel.
+
#* 設定条件が不確かな場合は、C4D Profilerを活用して至適な設定条件を求めます。詳細は該当するアプリケーションを参照します。Profilerを使って設定条件を求める場合はチャネルにBGEを充填して行って下さい。
# If separating cations, pipette 50 µL of the BGE into Reservoir 2 and Reservoir 3. Pipette 50 µL of the sample into Reservoir 1.
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# 陽イオンの分離測定には、リザーバ2と3にBGEを 50 µL 注入し、リザーバ1にはサンプル液を 50 µL 分注
# If separating anions, pipette 50 µL of the BGE into Reservoir 2. Pipette 50 µL of the sample into Reservoir 1 and Reservoir 3.
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# 陰イオンの分離測定には、リザーバ2にBGEを 50 µL 注入し、リザーバ1と3にはサンプル液を 50 µL 分注
# Visually check that you have the same volume of solution in each of the reservoirs.
+
# 各リザーバに等量入っている事を目視で確認
# Place the cover plate onto the holder.
+
# ホルダーの上にカバープレートを置く
# Click Zero in the Offset box.
+
# Offsetボックスで<zero>をクリック
# You may need to select a smaller value for the Range at this point. Click OK twice to return to the Manual Sampling window.
+
# ここで Manual Samplingウィンドウに戻り、入力の<Range>を設定します。
# Arm the HVS by pressing and holding the red button on the front of the HVS unit.
+
# HVS前面の赤ボタンを押し装置を起動させます。
# You are now ready to analyse your sample. In the PowerChrom software, click “Start”.
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# これで測定の準備がせきました。PowerChrom ソフトウェアから“Start”で始めます。
# In the Sequencer software, click “Run” to start the HVS sequence. This should trigger the PowerChrom software to start recording.
+
# Sequencerソフトウェアで<Run>をクリックしHVS シーケンスをスタート始します。PowerChrom ソフトウェアにトリガーがかかり記録を開始します。
  
=== Results for Cations ===
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=== カチオンの測定 ===
The electropherogram for the cations, run at 100 µM concentration, is shown in Figure 4. As predicted by Peakmaster software, three negative peaks are observed. The peaks are negative because the three cations Li<sup>+</sup>, Na<sup>+</sup> and K<sup>+</sup> are less conductive than the H<sup>+</sup> cation they are displacing in the background electrolyte. The electropherogram can be recorded with positive peaks by selecting Invert in the C4D Amplifier window, in the Hardware Settings of the PowerChrom software.
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カチオン標準液の電気泳動図です。Peakmaster ソフトウェアで予測した様に、三種類のネガティブピークが得られました。
 
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ピークがネガティブ(負の値)なのは、この三種類の陽イオン Li<sup>+</sup>、Na<sup>+</sup>、K<sup>+</sup> がバックグランド電解液中では H<sup>+</sup> のカチオンよりも電導度が低く作用する為です。PowerChromソフトウェアの<Hardware Settings>からC4D Amplifierウィンドウで<Invert>を選べばポジティブピークに代わります。
Figure 4 shows the data with a sample injection time of 20 seconds. Increasing the injection time, to 30 and 40 seconds, resulted in larger peaks but the separation of the peaks was not as good.
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図4のデータはサンプルインジェクッションタイムが20秒の設定ですが、30秒か40秒に増やせばピークは大きくなりますがピークの分離は劣化します。
  
 
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| [[File:Figure 4. Cations at 100 µM concentration.jpg|300px|thumb|right|Figure 4. Cations at 100 µM concentration]]
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| [[File:Figure 4. Cations at 100 µM concentration.jpg|300px|thumb|right|4. 濃度 100 µMのカチオン]]
 
|}
 
|}
  
=== Results for Anions ===
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=== アニオンの測定 ===
Figure 5 shows the electropherogram for anion analysed at 1mM. This concentration will overload the system, resulting in one large peak which cannot be resolved.
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図5は1mMのアニオンの電気泳動図です。この濃度ではシステムがオーバロードしてしまい、その結果一つの大きな未分化ピークしか記録できていません。
  
The solution for running anions should be diluted to 100 µM with deionised water. The electropherogram is shown in Figure 6. Peakmaster software predicts the two positive peaks obtained, where the HSO<sub>4</sub><sup>-</sup> and NO<sub>3</sub><sup>-</sup> peaks cannot be resolved. Separating the anions under these conditions will not produce an EOF peak, because the EOF travels away from the detector, towards Reservoir 2.
+
アニオンの測定では標準液をイオン交換水で100 µM に希釈する必要があります。図6は希釈した測定例です。Peakmasterソフトウェアで二つのピークが確認できますが、 HSO<sub>4</sub><sup>-</sup> NO<sub>3</sub><sup>-</sup> は一つの未分化ピークとなっています。この条件でのアニオンの分離測定ではEOFのピークは生じません。EOFはリザーバ2の方向に移動しますので検出器には捉えられません。
  
 
{|
 
{|
| [[File:Figure 5. Anions overloading at 1 mM concentration.jpg|300px|thumb|Figure 5. Anions overloading at 1 mM concentration]]
+
| [[File:Figure 5. Anions overloading at 1 mM concentration.jpg|300px|thumb|5. 濃度1 mM ではアニオンがオーバロード]]
| [[File:Figure 6. Anions at 100 µM concentration.jpg|300px|thumb|Figure 6. Anions at 100 µM concentration ]]
+
| [[File:Figure 6. Anions at 100 µM concentration.jpg|300px|thumb|6. 濃度100 µMのアニオンのピーク ]]
 
|}
 
|}
  
=== Procedure for Changing the Sample ===
+
=== サンプル液を交換する手順 ===
# Disarm the HVS.
+
# HVSの電源を切る
# Remove the cover plate from the platform.
+
# プラットフォームからカバープレートを外す
# Remove the sample from the sample reservoir using a pipette.
+
# ピペットでサンプルリザーバからサンプル液を取り除く
# Flush the sample reservoir a few times using deionised water.
+
# イオン交換水でサンプルリザーバを数回洗い流す
# Pipette 50 µL of the new sample into the sample reservoir.
+
# サンプルリザーバに別のサンプル液 50 µL をピペットで分注する.
# Replace the cover plate.
+
# カバープレートを戻す
# Arm the HVS.
+
# HVSの電源を入れる
# Begin the analysis of the new sample.
+
# 新しいサンプル液をの測定を始める
  
=== Procedure for Removing the Microchip ===
+
=== マイクロチップを取り外す手順 ===
# Disarm the HVS.
+
# DHVSの電源を切る
# Remove the cover plate from the platform.
+
# プラットフォームからカバープレートを外す
# Remove the solution from each of the reservoirs using a pipette.
+
# ピペットで各リザーバから溶液を取り除く
# To prevent formation of salt crystals inside the channel during storage, pipette deionised water into each of the reservoirs.
+
# マイクロチップのチャネルに塩が析出しないように、ピペットで各リザーバの中をイオン交換水で十分に洗い流す
# Flush the microchip by placing the syringe into the Reservoir 4 and gently pressing on the syringe, holding the pressure for ten seconds.
+
# リザーバ4にシリンジを差し込み、シリンジを10秒ほど軽く押して加圧しフラッシングする
# Remove the deionised water from each of the reservoirs using a pipette.
+
# ピペットで各リザーバからイオン交換水を抜き取る
# Remove the reservoir cover and dry the o-rings underneath the cover using a tissue.
+
# リザーバカバーを外し、カバー下のO-リングをティッシュで拭いて湿気を取る
# Remove the chip.
+
# マイクロチップを取り外す
  
=== Notes ===
+
=== 注意 ===
It is sometimes necessary to filter the BGE and sample solutions to prevent particles from blocking the narrow channel of the chip. This can be achieved by using a filter which fits onto the end of the syringe.
+
予めBGE 溶液やサンプル液をフィルター処理しておくのも必要です。狭いチップチャネルに微粒子が混入するのを防ぎます。シリンジの先端に装着できるタイプのフィルター をが便利です。
  
It may also be necessary to place the BGE and sample solutions in an ultra-sonic bath to remove any dissolved air in the solutions. Dissolved air can cause the formation of air bubbles in the channel, which can result in an electric arc when the high voltage is applied. This produces high temperatures in the channel which can damage the channel of the chip.
+
同様に、BGE 溶液やサンプル液を超音波槽で処理し脱気しておきましょう。
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溶液中に溶存エアーがあるとチャネル内に気泡を生む要因となり、高電圧をかけると放電を起こしチャネル内の温度が上がってチップのチャネルが損傷する恐れがあります。
  
Observing the current flowing through the channel of the chip can be useful when developing a method. This current is displayed in the Sequencer software, and it can be recorded from the monitor connectors at the back of the HVS. If the current reads zero, or is very noisy, during the separation step, this suggests there is an air bubble in channel.
+
チップのチャネルに流れる電流を観測しながら測定メソードを見つけるのが賢明です。
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Sequencerソフトウェアで電流値が表示しますので、HVS本体後部のモニター端子からシグナルを記録することができます。電流がゼロになったりノイズが多い場合はチャネルに気泡が生じた疑いがあります。
  
If the channel of the chip becomes blocked with particles, it may be possible to clear the obstruction, either by injecting air into one end of the channel using a syringe, or by using a weak vacuum at one end of the channel. Use a lint-free tissues, as opposed to normal tissues, to prevent particles from blocking the channel of the chip.
+
微粒子によってチップチャネルの流路が塞がれてしまった場合は、チャネルの一方にシリンジを使って空気で加圧するか、軽く減圧することで取り除くことができるかも知れません。
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ティッシュペーパを使う際は糸くずの出ないタイプを使ってください。
  
If the sample peaks get progressively smaller over successive runs, this may be due to the depletion of ions in the sample reservoir close to the start of the channel. You can mix the sample in the reservoir, by using a pipette to suck the sample in and out of the pipette a few times.
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連続測定中に回を追うごとに次第にピークが小さくなってくる場合は、チャネルの先頭部に面する同じリザーバ内イオンを検出している恐れがありますので、ピペットを使ってサンプル液を吸引しながら出し入れを数回繰り返してリザーバ内のサンプル液を混ぜ合わせます。
  
If the baseline begins to drift a lot during the analysis, it may be useful to flush the chip using the syringe. Place the syringe into the outlet reservoir and gently press on the syringe and hold the pressure for ten seconds.
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測定中にベースラインのドリフトが著しい時は、シリンジを使ってチップをフラッシュすると効果的です。リザーバの出口にシリンジをセットし 、軽くシリンジを押しながら数秒間加圧状態を保ちます。
  
You may have to the alter the Offset and change the Range several times during a series of runs, but do NOT alter the Frequency, Amplitude or Headstage Gain settings until you have completed all the calibration and sample runs in an experiment.
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連続測定する時は途中で幾度かオフセットを変更したり測定レンジを変える必要はありますが、実験中はキャリブレーションやサンプル測定が全て終了する迄は      < Frequency >、< Amplitude >、< Headstage Gain > の設定は変更すべきではありません。
  
=== Cleaning and Storing the Chip ===
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=== チップの洗浄と保存 ===
The chip can be rinsed and emptied while it is still in the Chip Platform. This is done by pushing the nozzle of a syringe into the sloping reservoir holes of the reservoir cover and gently pushing on the plunger to apply pressure.
+
チッププラットフォームにセットしたままチップを洗い流すことは可能です。シリンジのノズルをリザーバカバーのホールの斜面に当て、プランジャーを軽く押し加圧しながらチップ内の溶液を押し出して洗い流します。
  
Alternatively, this can be done with the chip removed from the Chip Platform, by using a syringe with a rubber O-ring connected to its nozzle. To make this device, cut most of the nozzle from a syringe and glue a rubber O-ring to the end of the syringe. The O-ring is then pushed down onto the glass surface of the chip above the reservoir. The plunger is gently pushed to force liquid or air through the channel of the chip.
+
またはプラットフォームからチップを外し、ノズルにゴム製のO-リングを取り付けたシリンジを用意てチップチャネルを洗います。このシリンジはノズルの部分を付け根だけ残して切り取り、接着剤を塗ってO-リングを取り付けて作ります。次に、リザーバ上のチップのガラス表面の上にO-リングを当てます。プランジャーを軽く押しながらチップチャネル内の水や空気を押し出します。
  
For the optimum performance, the chip should be properly treated after use to clean the glass surface and restore the EOF properties. Please follow the instructions provided by the chip manufacturer.
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良好な測定結果を得る為にも使用した後のチップの保守管理には細心の注意を払って保管します。チップのガラス表面にも汚れが付かない様に注意します。チップメーカの取説書に従って保管してください。
  
 
== Gated Injection ==
 
== Gated Injection ==
=== Introduction ===
+
=== はじめに ===
The previous experiment described a Floating Injection, where the reservoirs at the ends of the long separating channel (Reservoirs 2 and 4) are disconnected from the High Voltage Sequencer during the sample injection step. An alternative type of injection, called a Gated Injection, may also be used. A Gated Injection requires two units of the ER230 High Voltage Sequencer, as the voltages at all four reservoirs need to be controlled.
+
これまでの説明は Floating Injection 法によるサンプル液注入でした。この方法ではインジェクション中は泳動チャネル端末のリザーバ(リザーバ2,4)には高電圧シーケンサは接続していませんでした。
 +
これとは異なりここで紹介する Gated Injection と呼ばれる方法では、ER430 高電圧シーケンサを使って4箇所全てのリザーバにかける電圧をコントロールします。
  
=== Procedure ===
+
=== 手順 ===
[[File:Table 4. Connecting Chip Platform to HVS for a Gated Injection.jpg|300px|thumb|right|Table 4. Connecting Chip Platform to HVS for a Gated Injection]]
+
[[File:Table 4. Connecting Chip Platform to HVS for a Gated Injection.jpg|300px|thumb|right|4. Gated Injection でのチッププラットフォーム
The hardware should be setup as described for the Floating Injection, except the Chip Platform should be connected to the HVS as shown in Table 4.
+
とHVSの接続]]
 +
ハードウェアのセットアップはFloating Injectionと同じですが、チッププラットフォームは表4に従ってHVSと接続する必要があります。
  
In the Sequencer software, setup a sequence as shown in Table 5 for cations. For the separation of anions, the polarities of the applied voltages are reverse (set all the voltages in Table 5 to negative values).
+
カチオンの分離測定ではSequencerソフトウェアで表5に従ってシーケンスを設定します。アニオンの場合はかける電圧の極性を反転させますので、表5に示す電圧値は全て負(-)に設定します。
  
In the sequence, make sure that you enter the trigger command for the correct HVS. For example, if you have connected the trigger cable to the Master HVS hardware, make sure you enter the “High/Closed” command in the Digital Out column for the Master HVS.
+
シーケンスでは接続したHVSに適合するトリガーコマンドを設定します。例えばHVS本体にトリガーケーブルをつないだ場合はDigital Out欄には“High/Closed”コマンドを入力します。
  
The sample should be diluted to 100 µM with deionised water. Pipette 50 µL of BGE into Reservoir 4, 3 and 1, and 50 µL of sample into Reservoir 2.
+
サンプル液をイオン交換水100 µM に希釈します。リザーバ 3、4にBGEを50 µL分注し、リザーバ1、2には50 µLのサンプル液を注入します。
  
Follow the rest of the instructions to start the PowerChrom and Sequencer softwares.
+
これ以降は同じ手順で、PowerChrom と Sequencerソフトウェアをスタートします。
  
[[File:Table 5. Sequence for separating cations using a Gated Injection.jpg|900px|thumb|center|Table 5. Sequence for separating cations using a Gated Injection]]
+
[[File:Table 5. Sequence for separating cations using a Gated Injection.jpg|900px|thumb|center|5.Gated Injectionでのカチオン分離測定のシーケンス]]
  
[[File:Figure 7. Flow during Initial-Separation Step.jpg|300px|thumb|right|Figure 7. Flow during Initial/Separation Step]]
+
[[File:Figure 7. Flow during Initial-Separation Step.jpg|300px|thumb|right|7. Initial/Separation工程でのフロー]]
[[File:Figure 8. Flow during Injection Step.jpg|300px|thumb|right|Figure 8. Flow during Injection Step]]
+
[[File:Figure 8. Flow during Injection Step.jpg|300px|thumb|right|8.Injection工程でのフロー]]
=== Flow of Sample and BGE ===
+
During the initial/separation step (shown in Figure 7) there is a constant flow of sample from Reservoir 2 to Reservoir 1, while the BGE flows from Reservoir 3 to Reservoir 4. There is also flow of BGE from Reservoir 3 to Reservoir 1, which keeps the sample out of the separation channel.
+
  
After 45 seconds, the injection step occurs (shown in Figure 8). The voltage at Reservoir 3 is reduced, from 1000V to 4000V, for a fraction of a second. This allows a plug of sample into the separation channel.
+
=== サンプル液とBGEのフロー ===
 +
Initial/separationの工程(図7参照)では、リザーバ2からリザーバ1へサンプルが定速で流れ(フロー)ます。その間リザーバ3からリザーバ4へはBGEがフローします。同時にリザーバ3からリザーバ1にはBGEがフローしますが、サンプルは分離チャネルの外に留まっています。
  
When the voltage at Reservoir 3 is restored to its original value, the sample plug is broken off and separated as it flows towards Reservoir 4 and the detector.
+
45秒後、インジェクション工程(図8参照)が始まります。リザーバ3の電圧が1000Vから400Vに一瞬で下がります。この影響でサンプルは分離チャネル内に差し込まれます。 
  
=== Notes for Gated Injections ===
+
リザーバ3の電圧が元の電圧に戻ると、サンプルへの差し込みが外れてリザーバ4と検出器の方向へ分離移動し始めます。
The amount of sample injected is a function of the length of time of the injection. The formation of the sample plug injected into the separation channel is a combination of electromigration and EOF (if the EOF is in the same direction as the electromigration). This type of injection may produce an electrokinetic bias: faster migrating compounds are introduced into the separation channel in a greater quantity than slower migrating compounds.
+
  
Contamination in the chip can reduce the surface charge on the surface of the channel. This explains why the EOF peak may be smaller, or may not be seen at all, when using a chip had been used many times.
+
=== Gated Injectionsの注意点 ===
 +
インジェクションするサンプル量はインジェクションタイムの長さに比例します。分離チャネルに押し出されるサンプルインジェクション量はエレクトロマイグレーション(電子移動)とEOF(EOF電気浸透流がエレクトロマイグレーションと同方向であれば)との相乗効果で働きます。このタイプのインジェクションには導電学的なバイアスがかかるかも知れません:遅い移動成分に比べより速い移動成分がより多く分離チャネル内に誘導されます。
 +
チップ内にコンタミがあるとチャネル表面の表面電荷が減少することがあります。これがEOFピークが段々小さくなる要因となります。

Latest revision as of 19:04, 7 December 2021

Video 1. C4Dを使ったマイクロチップ電位泳動法の手順

非接触電導度検出器(C4D)を用いたマイクロチップ電気泳動法(MCE)の手順

はじめに

図 1. マイクロチップ

このアプリケーションノートでは、静電結合型非接触電気 電導度検出器(C4D)を使ったマイクロチップ電気泳動法(MCE-C4D)の操作手順をステップ-バイ-ステップで説明します。 eDAQ マイクロチップ電気泳動システムには、C4D データシステム、C4D マイクロチッププラットフォーム、高電圧シーケンサー、C4D の電極を埋め込んだマイクロチップ、カチオン及びアニオンを含む標準液キットが含まれています。

図 1 は使用するマイクロチップの構造を示した写真です。

必要な装置

ER255 及び ER455 マイクロチップ電気泳動システム

フローティングインジェクション

ここではフローティングインジェクション法によるマイクロチップ電気泳動の操作手順を紹介します。この種のインジェクションでは、チップにある4つのリザーバの内、2箇所に電圧を設定します。従ってこの方法では、1台の高電圧シーケンサを使います。 フローティングインジェクションを行う間は、チップの両端(リザーバ 1 と 3 の間)に 1000 V かけます。チップのチャネル(流路)はダブル-T字の構造で、この電位がチャネルの僅かな間隙全体に及びます。分離工程ではチップに沿って(リザーバ2と4) 1000 V かかることになります。この結果、サンプルは検出器とリザーバ4の方に移動し、それにつれてイオンが分離します。 ゲートインジェクション法では後述するように、4か所全てのリザーバで電圧のコントローラが必要(従って2台の高電圧シーケンサーが必要)となります。

必要な装置

表 1. チッププラットフォームと HVS を接続し、フローティングインジェクションを行う。

eDAQ マイクロチップ電気泳動キットには多くのコンポーネントとケーブルが含まれています。次の手順に従ってください。

  1. まず、パッキングリストに記載した品目が全て揃っているか確認してください。
  2. コンピュータに Sequencer ソフトウェアと PowerChrom ソフトウェアをインストールします。インストールしたバージョンが最新バージョンなのか edaq.com/software_downloads.html で確認してください。
  3. 操作マニュアルに従って、高電圧シーケンサ(HVS)をUSB ケーブルでコンピュータに接続します。但し電源は未だ入れないでください
  4. 同様に、C4Dデータシステムをマニュアルに従いUSBケーブルでコンピュータにつなぎます。電源は入れない事。
  5. HDMI ケーブルを使って、チッププラットフォームをC4Dデータシステムにつなぎます。
  6. 表1に従って、カラーで識別した高電圧ケーブルを使ってチッププラットフォームをHVSに接続します。
    • 黒色の HVS ケーブルは2種類ありますので必ず正しい方をつないでください。45 mm マイクロチップを使っている場合は、プラットフォーム中央部の黒色ケーブルを使います。
    • チッププラットフォームと HVS 間はインターロックケーブルで接続します。注:カバープレートがプラットフォームから持ち上がっている場合は、インターロックがかかり電源は入りません。絶対にインターロックケーブルを迂回させないこと。
  7. チップホルダーは必ずアースを取り、シグナルのノイズを抑えます。緑のグランドケーブルを使ってチッププラットフォームのグランドコネクターと C4D データシステム後部の緑のコネクターとをつなぎます。同様に、もう一本のグランドケーブルで C4D システムの緑のコネクターと HVS 後部の緑のコネクターとをつなぎます。
    Video 2. HV シーケンサーからPowerChromソフトウェアをトリガーする設置法
  8. HVS からPowerChrom ソフトウェアにトリガーを掛けて記録を開始させることができます。赤と黒のトリガーケーブルを使って、HVS 後部の “CTL1 +” と C4D データシステムの “TRIG +” とをつなぎ、HVS の “CTL1 –” と C4D の “TRIG –” をつなぎます。 Video 2 参照。
  9. HVS の電源を入れます。初めて使う場合はドライバーがインストールされます。
  10. Sequencer ソフトウェアを開き、画面上の<Online>ボタンをクリックしてHVSに接続できるのを確認します。これには <File> メニューから<Preferences>を選び 対応するHVSの<Connection Serial Port>を設定します。Serial Port Monitorソフトウェア(eDAQ website から入手可能)を使えばどのCOMポートがHVSに接続しているのかが判ります。Sequencerソフトウェア画面をリサイズして画面の左側に移動します。
  11. PowerChromソフトウェアを開き、Easy Access ウィンドウが表示するのを確認し装置の設定を行います(Hardware Unavailableウィンドウが表示する時はソフトウェアが装置を認識していませんので、操作マニュアルを参照して問題を解決してください)。PowerChromソフトウェア画面をリサイズして画面の右側に移動します。
  12. 下記に従って、ソフトウェア上でトリガーコマンドを設定します:
    • Sequencerソフトウェア: <File>メニューの<Preferences>から<Contact Closure>を選ぶ。
    • PowerChromソフトウェア: in the menu <Edit>メニューの<Preferences>から<Digital IO Settings>で<External Trigger Mode>の<Voltage Level (TTL)>を選択。
    • PowerChromソフトウェア:Manual Sampling画面で<Inject Settings>から<Wait for Inject>を選ぶ。
    • Sequencerソフトウェア:後の手順になりますが、シークエンスをセッティングする時に<Digital Output 1>では<High/Closed>を選ぶことを忘れないでください。これがトリガーコマンドになります。同様に最終ステップでは<Low/Open>にするのを忘れない様に (分離工程の終了後)。
  13. 手袋を使ってチップ・プラットフォームに未使用のマイクロチップを置きます。四箇所の円形C4Dコネクターがプラットフォームの4個のピンの上に当たるようにチップを取り付けます。
  14. リザーバ―にカバーを載せます。
    • カバーの下のO-リングが定位置にあり乾いているのを確認します。必要ならティッシュで拭いて乾かしてください。
    • ネジを締め過ぎないように;指で回して締まる程度で十分です。
    • リザーバのカバーは水平に、プラットフォームの底面と平行にします。
  15. カバープレートをプラットフォームの上に載せます。必要なら高電圧ケーブルを動かしてプラットフォームの底面と平行にします。

Sequencer ソフトウェア

  1. Sequencerソフトウェアを開きOnlineモードにします。
  2. 陽イオン分離測定には表2を、陰イオンの分離測定には表3に従ってシークンスセットアップします。何れもFloating Injection法を用います。


表 2. Floating Injectionで陽イオンを分離測定
表 3. Floating Injectionで陰イオンを分離測定

PowerChromソフトウェアと溶液の充填

  1. PowerChrom ソフトウェアを開く
  2. Easy Accessウィンドウの<Manual Run>をクリック
  3. Manual Sampling ウィンドウの<Inject Settings>をクリックし、<Wait for Inject>を選び <OK> (<Start>を選ぶと直ちに記録を開始)
  4. Manual Sampling ウィンドウで Stop sampling 2.00 min after Injectに設定
  5. <Hardware Settings>をクリックし、以下を設定しOK:
    • Sampling speed = 100/s
    • Channel 1: Input = Input 1, Range = 50 mV
    • Channel 2: Input = Off
  6. <C4D Amplifier>をクリックし以下を設定:
    • Low Pass = 5 Hz
    • Offsetで <Zero>をクリック
  7. サンプル1 mM をイオン交換水で100 µM に希釈
    図 3.マイクロチップリザーバへの溶液の分注
  8. リザーバ4にBGEを50 µL分注する。毛細管現象により1秒足らずでチャネルに溶液が充填されます。充填するのをC4Dシグナルの電導度の変化で確認します。
    • リーザーバに溶液を分注する間はピペットを垂直に保ったままの状態にします。
    • この時ピペットをリザーバの傾斜壁に軽く当てながら溶液を分注してください。リザーバの底に気泡が入るのを防ぐ為です。
    • BGEやサンプルを分注する時とリザーバから溶液を取り除く際はピペットチップを交換してください。溶液のコンタミを防ぐ為です。
  9. PowerChromソフトウェア:
    • 予めC4Dの設定条件が判っている時は、C4DのAmplifierウィンドウで<Frequency>、<Amplitude>、<Headstage Gain>を設定するか、
    • 設定条件が不確かな場合は、C4D Profilerを活用して至適な設定条件を求めます。詳細は該当するアプリケーションを参照します。Profilerを使って設定条件を求める場合はチャネルにBGEを充填して行って下さい。
  10. 陽イオンの分離測定には、リザーバ2と3にBGEを 50 µL 注入し、リザーバ1にはサンプル液を 50 µL 分注
  11. 陰イオンの分離測定には、リザーバ2にBGEを 50 µL 注入し、リザーバ1と3にはサンプル液を 50 µL 分注
  12. 各リザーバに等量入っている事を目視で確認
  13. ホルダーの上にカバープレートを置く
  14. Offsetボックスで<zero>をクリック
  15. ここで Manual Samplingウィンドウに戻り、入力の<Range>を設定します。
  16. HVS前面の赤ボタンを押し装置を起動させます。
  17. これで測定の準備がせきました。PowerChrom ソフトウェアから“Start”で始めます。
  18. Sequencerソフトウェアで<Run>をクリックしHVS シーケンスをスタート始します。PowerChrom ソフトウェアにトリガーがかかり記録を開始します。

カチオンの測定

カチオン標準液の電気泳動図です。Peakmaster ソフトウェアで予測した様に、三種類のネガティブピークが得られました。 ピークがネガティブ(負の値)なのは、この三種類の陽イオン Li+、Na+、K+ がバックグランド電解液中では H+ のカチオンよりも電導度が低く作用する為です。PowerChromソフトウェアの<Hardware Settings>からC4D Amplifierウィンドウで<Invert>を選べばポジティブピークに代わります。 図4のデータはサンプルインジェクッションタイムが20秒の設定ですが、30秒か40秒に増やせばピークは大きくなりますがピークの分離は劣化します。

図 4. 濃度 100 µMのカチオン

アニオンの測定

図5は1mMのアニオンの電気泳動図です。この濃度ではシステムがオーバロードしてしまい、その結果一つの大きな未分化ピークしか記録できていません。

アニオンの測定では標準液をイオン交換水で100 µM に希釈する必要があります。図6は希釈した測定例です。Peakmasterソフトウェアで二つのピークが確認できますが、 HSO4- と NO3- は一つの未分化ピークとなっています。この条件でのアニオンの分離測定ではEOFのピークは生じません。EOFはリザーバ2の方向に移動しますので検出器には捉えられません。

図 5. 濃度1 mM ではアニオンがオーバロード
図 6. 濃度100 µMのアニオンのピーク

サンプル液を交換する手順

  1. HVSの電源を切る
  2. プラットフォームからカバープレートを外す
  3. ピペットでサンプルリザーバからサンプル液を取り除く
  4. イオン交換水でサンプルリザーバを数回洗い流す
  5. サンプルリザーバに別のサンプル液 50 µL をピペットで分注する.
  6. カバープレートを戻す
  7. HVSの電源を入れる
  8. 新しいサンプル液をの測定を始める

マイクロチップを取り外す手順

  1. DHVSの電源を切る
  2. プラットフォームからカバープレートを外す
  3. ピペットで各リザーバから溶液を取り除く
  4. マイクロチップのチャネルに塩が析出しないように、ピペットで各リザーバの中をイオン交換水で十分に洗い流す
  5. リザーバ4にシリンジを差し込み、シリンジを10秒ほど軽く押して加圧しフラッシングする
  6. ピペットで各リザーバからイオン交換水を抜き取る
  7. リザーバカバーを外し、カバー下のO-リングをティッシュで拭いて湿気を取る
  8. マイクロチップを取り外す

注意

予めBGE 溶液やサンプル液をフィルター処理しておくのも必要です。狭いチップチャネルに微粒子が混入するのを防ぎます。シリンジの先端に装着できるタイプのフィルター をが便利です。

同様に、BGE 溶液やサンプル液を超音波槽で処理し脱気しておきましょう。 溶液中に溶存エアーがあるとチャネル内に気泡を生む要因となり、高電圧をかけると放電を起こしチャネル内の温度が上がってチップのチャネルが損傷する恐れがあります。

チップのチャネルに流れる電流を観測しながら測定メソードを見つけるのが賢明です。 Sequencerソフトウェアで電流値が表示しますので、HVS本体後部のモニター端子からシグナルを記録することができます。電流がゼロになったりノイズが多い場合はチャネルに気泡が生じた疑いがあります。

微粒子によってチップチャネルの流路が塞がれてしまった場合は、チャネルの一方にシリンジを使って空気で加圧するか、軽く減圧することで取り除くことができるかも知れません。 ティッシュペーパを使う際は糸くずの出ないタイプを使ってください。

連続測定中に回を追うごとに次第にピークが小さくなってくる場合は、チャネルの先頭部に面する同じリザーバ内イオンを検出している恐れがありますので、ピペットを使ってサンプル液を吸引しながら出し入れを数回繰り返してリザーバ内のサンプル液を混ぜ合わせます。

測定中にベースラインのドリフトが著しい時は、シリンジを使ってチップをフラッシュすると効果的です。リザーバの出口にシリンジをセットし 、軽くシリンジを押しながら数秒間加圧状態を保ちます。

連続測定する時は途中で幾度かオフセットを変更したり測定レンジを変える必要はありますが、実験中はキャリブレーションやサンプル測定が全て終了する迄は < Frequency >、< Amplitude >、< Headstage Gain > の設定は変更すべきではありません。

チップの洗浄と保存

チッププラットフォームにセットしたままチップを洗い流すことは可能です。シリンジのノズルをリザーバカバーのホールの斜面に当て、プランジャーを軽く押し加圧しながらチップ内の溶液を押し出して洗い流します。

またはプラットフォームからチップを外し、ノズルにゴム製のO-リングを取り付けたシリンジを用意てチップチャネルを洗います。このシリンジはノズルの部分を付け根だけ残して切り取り、接着剤を塗ってO-リングを取り付けて作ります。次に、リザーバ上のチップのガラス表面の上にO-リングを当てます。プランジャーを軽く押しながらチップチャネル内の水や空気を押し出します。

良好な測定結果を得る為にも使用した後のチップの保守管理には細心の注意を払って保管します。チップのガラス表面にも汚れが付かない様に注意します。チップメーカの取説書に従って保管してください。

Gated Injection

はじめに

これまでの説明は Floating Injection 法によるサンプル液注入でした。この方法ではインジェクション中は泳動チャネル端末のリザーバ(リザーバ2,4)には高電圧シーケンサは接続していませんでした。 これとは異なりここで紹介する Gated Injection と呼ばれる方法では、ER430 高電圧シーケンサを使って4箇所全てのリザーバにかける電圧をコントロールします。

手順

表 4. Gated Injection でのチッププラットフォーム とHVSの接続

ハードウェアのセットアップはFloating Injectionと同じですが、チッププラットフォームは表4に従ってHVSと接続する必要があります。

カチオンの分離測定ではSequencerソフトウェアで表5に従ってシーケンスを設定します。アニオンの場合はかける電圧の極性を反転させますので、表5に示す電圧値は全て負(-)に設定します。

シーケンスでは接続したHVSに適合するトリガーコマンドを設定します。例えばHVS本体にトリガーケーブルをつないだ場合はDigital Out欄には“High/Closed”コマンドを入力します。

サンプル液をイオン交換水100 µM に希釈します。リザーバ 3、4にBGEを50 µL分注し、リザーバ1、2には50 µLのサンプル液を注入します。

これ以降は同じ手順で、PowerChrom と Sequencerソフトウェアをスタートします。

表 5.Gated Injectionでのカチオン分離測定のシーケンス
図 7. Initial/Separation工程でのフロー
図 8.Injection工程でのフロー

サンプル液とBGEのフロー

Initial/separationの工程(図7参照)では、リザーバ2からリザーバ1へサンプルが定速で流れ(フロー)ます。その間リザーバ3からリザーバ4へはBGEがフローします。同時にリザーバ3からリザーバ1にはBGEがフローしますが、サンプルは分離チャネルの外に留まっています。

45秒後、インジェクション工程(図8参照)が始まります。リザーバ3の電圧が1000Vから400Vに一瞬で下がります。この影響でサンプルは分離チャネル内に差し込まれます。

リザーバ3の電圧が元の電圧に戻ると、サンプルへの差し込みが外れてリザーバ4と検出器の方向へ分離移動し始めます。

Gated Injectionsの注意点

インジェクションするサンプル量はインジェクションタイムの長さに比例します。分離チャネルに押し出されるサンプルインジェクション量はエレクトロマイグレーション(電子移動)とEOF(EOF電気浸透流がエレクトロマイグレーションと同方向であれば)との相乗効果で働きます。このタイプのインジェクションには導電学的なバイアスがかかるかも知れません:遅い移動成分に比べより速い移動成分がより多く分離チャネル内に誘導されます。 チップ内にコンタミがあるとチャネル表面の表面電荷が減少することがあります。これがEOFピークが段々小さくなる要因となります。