C4Dマイクロチップ電気泳動の原理および使用方法

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Video 1. C4Dを使ったマイクロチップ電位泳動法の手順

非接触電導度検出器(C4D)を用いたマイクロチップ電気泳動法(MCE)の手順

はじめに

図 1. マイクロチップ

このアプリケーションノートでは、静電結合型非接触電気 電導度検出器(C4D)を使ったマイクロチップ電気泳動法(MCE-C4D)の操作手順をステップ-バイ-ステップで説明します。 eDAQ マイクロチップ電気泳動システムには、C4D データシステム、C4D マイクロチッププラットフォーム、高電圧シーケンサー、C4D の電極を埋め込んだマイクロチップ、カチオン及びアニオンを含む標準液キットが含まれています。

図 1 は使用するマイクロチップの構造を示した写真です。

必要な装置

ER255 及び ER455 マイクロチップ電気泳動システム

フローティングインジェクション

ここではフローティングインジェクション法によるマイクロチップ電気泳動の操作手順を紹介します。この種のインジェクションでは、チップにある4つのリザーバの内、2箇所に電圧を設定します。従ってこの方法では、1台の高電圧シーケンサを使います。 フローティングインジェクションを行う間は、チップの両端(リザーバ 1 と 3 の間)に 1000 V かけます。チップのチャネル(流路)はダブル-T字の構造で、この電位がチャネルの僅かな間隙全体に及びます。分離工程ではチップに沿って(リザーバ2と4) 1000 V かかることになります。この結果、サンプルは検出器とリザーバ4の方に移動し、それにつれてイオンが分離します。 ゲートインジェクション法では後述するように、4か所全てのリザーバで電圧のコントローラが必要(従って2台の高電圧シーケンサーが必要)となります。

必要な装置

表 1. チッププラットフォームと HVS を接続し、フローティングインジェクションを行う。

eDAQ マイクロチップ電気泳動キットには多くのコンポーネントとケーブルが含まれています。次の手順に従ってください。

  1. まず、パッキングリストに記載した品目が全て揃っているか確認してください。
  2. コンピュータに Sequencer ソフトウェアと PowerChrom ソフトウェアをインストールします。インストールしたバージョンが最新バージョンなのか edaq.com/software_dnloads.html で確認してください。
  3. 操作マニュアルに従って、高電圧シーケンサ(HVS)をUSB ケーブルでコンピュータに接続します。但し電源は未だ入れないでください
  4. 同様に、C4Dデータシステムをマニュアルに従いUSBケーブルでコンピュータにつなぎます。電源は入れない事。
  5. HDMI ケーブルを使って、チッププラットフォームをC4Dデータシステムにつなぎます。
  6. 表1に従って、カラーで識別した高電圧ケーブルを使ってチッププラットフォームをHVSに接続します。
    • 黒色の HVS ケーブルは2本あるますので必ず正しい方をつないでください。45 mm マイクロチップを使っている場合は、プラットフォーム中央部の黒色ケーブルを使います。
    • チッププラットフォームと HVS 間はインターロックケーブルで接続します。注:カバープレートがプラットフォームから持ち上がっている場合は、インターロックがかかり電源は入りません。絶対にインターロックケーブルを迂回させないこと。
  7. チップホルダーは必ずアースを取り、シグナルのノイズを抑えます。緑のグランドケーブルを使ってチッププラットフォームのグランドコネクターと C4D データシステム後部の緑のコネクターとをつなぎます。同様に、もう一本のグランドケーブルで C4D システムの緑のコネクターと HVS 後部の緑のコネクターとをつなぎます。
    Video 2. HV シーケンサーからPowerChromソフトウェアをトリガーする設置法
  8. HVS からPowerChrom ソフトウェアにトリガーを掛けて記録を開始させることができます。赤と黒のトリガーケーブルを使って、HVS 後部の “CTL1 +” と C4D データシステムの “TRIG +” とをつなぎ、HVS の “CTL1 –” と C4D の “TRIG –” をつなぎます。 Video 2 参照。
  9. HVS の電源を入れます。初めて使う場合はドライバーがインストールされます。
  10. Sequencer ソフトウェアを開き、画面上の<Online>ボタンをクリックしてHVSに接続できるのを確認します。これには <File> メニューから<Preferences>を選び 対応するHVSの<Connection Serial Port>を設定します。Serial Port Monitorソフトウェア(eDAQ website から入手可能)を使えばどのCOMポートがHVSに接続しているのかが判ります。Sequencerソフトウェア画面をリサイズして画面の左側に移動します。
  11. PowerChromソフトウェアを開き、Easy Access ウィンドウが表示するのを確認し装置の設定を行います(Hardware Unavailableウィンドウが表示する時はソフトウェアが装置を認識していませんので、操作マニュアルを参照して問題を解決してください)。PowerChromソフトウェア画面をリサイズして画面の右側に移動します。
  12. 下記に従って、ソフトウェア上でトリガーコマンドを設定します:
    • Sequencerソフトウェア: <File>メニューの<Preferences>から<Contact Closure>を選ぶ。
    • PowerChromソフトウェア: in the menu <Edit>メニューの<Preferences>から<Digital IO Settings>で<External Trigger Mode>の<Voltage Level (TTL)>を選択。
    • PowerChromソフトウェア:Manual Sampling画面で<Inject Settings>から<Wait for Inject>を選ぶ。
    • Sequencerソフトウェア:後の手順になりますが、シークエンスをセッティングする時に<Digital Output 1>では<High/Closed>を選ぶことを忘れないでください。これがトリガーコマンドになります。同様に最終ステップでは<Low/Open>にするのを忘れない様に (分離工程の終了後)。
  13. 手袋を使ってチップ・プラットフォームに未使用のマイクロチップを置きます。四箇所の円形C4Dコネクターがプラットフォームの4個のピンの上に当たるようにチップを取り付けます。
  14. リザーバ―にカバーを載せます。
    • カバーの下のO-リングが定位置にあり乾いているのを確認します。必要ならティッシュで拭いて乾かしてください。
    • ネジを締め過ぎないように;指で回して締まる程度で十分です。
    • リザーバのカバーは水平に、プラットフォームの底面と平行にします。
  15. カバープレートをプラットフォームの上に載せます。必要なら高電圧ケーブルを動かしてプラットフォームの底面と平行にします。

Sequencer ソフトウェア

  1. Sequencerソフトウェアを開きOnlineモードにします。
  2. 陽イオン分離測定には表2を、陰イオンの分離測定には表3に従ってシークンスセットアップします。何れもFloating Injection法を用います。


Table 2. Sequence for separating cations using a Floating Injection
Table 3. Sequence for separating anions using a Floating Injection

PowerChromソフトウェアと溶液の充填

  1. PowerChrom ソフトウェアを開く
  2. Easy Accessウィンドウの<Manual Run>をクリック
  3. Manual Sampling ウィンドウの<Inject Settings>をクリックし、<Wait for Inject>を選び <OK> (<Start>を選ぶと直ちに記録を開始)
  4. Manual Sampling ウィンドウで Stop sampling 2.00 min after Injectに設定
  5. <Hardware Settings>をクリックし、以下を設定しOK:
    • Sampling speed = 100/s
    • Channel 1: Input = Input 1, Range = 50 mV
    • Channel 2: Input = Off
  6. <C4D Amplifier>をクリックし以下を設定:
    • Low Pass = 5 Hz
    • Offsetで <Zero>をクリック
  7. サンプル1 mM をイオン交換水で100 µM に希釈
    Figure 3. Pipetting solutions into the microchip reservoirs
  8. リザーバ4にBQEを50 µL分注する。毛細管現象により1秒足らずでチャネルに溶液が充填されます。充填するのをC4Dシグナルの電導度の変化で確認します。
    • リーザーバに溶液を分注する間はピペットを垂直に保ったままの状態にします。
    • この時ピペットをリザーバの傾斜壁に軽く当てながら溶液を分注してください。リザーバの底に気泡が入るのを防ぐ為です。
    • BGEやサンプルを分注する時とリザーバから溶液を取り除く際はピペットチップを交換してください。溶液のコンタミを防ぐ為です。
  9. PowerChromソフトウェア:
    • 予めC4Dの設定条件が判っている時は、C4DのAmplifierウィンドウで<Frequency>、<Amplitude>、<Headstage Gain>を設定するか、
    • 設定条件が不確かな場合は、C4D Profilerを活用して至適な設定条件を求めます。詳細は該当するアプリケーションを参照します。Profilerを使って設定条件を求める場合はチャネルにBGEを充填して行って下さい。
  10. 陽イオンの分離測定には、リザーバ2と3にBGEを 50 µL 注入し、リザーバ1にはサンプル液を 50 µL 分注
  11. 陰イオンの分離測定には、リザーバ2にBGEを 50 µL 注入し、リザーバ1と3にはサンプル液を 50 µL 分注
  12. 各リザーバに等量入っている事を目視で確認
  13. ホルダーの上にカバープレートを置く
  14. Offsetボックスで<zero>をクリック
  15. ここで Manual Samplingウィンドウに戻り、入力の<Range>を設定します a
  16. HVS前面の赤ボタンを押し装置を起動させます。
  17. これで測定の準備がせきました。PowerChrom ソフトウェアから“Start”で始めます。
  18. Sequencerソフトウェアで<Run>をクリックしHVS シーケンスをスタート始します。PowerChrom ソフトウェアにトリガーがかかり記録を開始します。

Results for Cations

The electropherogram for the cations, run at 100 µM concentration, is shown in Figure 4. As predicted by Peakmaster software, three negative peaks are observed. The peaks are negative because the three cations Li+, Na+ and K+ are less conductive than the H+ cation they are displacing in the background electrolyte. The electropherogram can be recorded with positive peaks by selecting Invert in the C4D Amplifier window, in the Hardware Settings of the PowerChrom software.

Figure 4 shows the data with a sample injection time of 20 seconds. Increasing the injection time, to 30 and 40 seconds, resulted in larger peaks but the separation of the peaks was not as good.

Figure 4. Cations at 100 µM concentration

Results for Anions

Figure 5 shows the electropherogram for anion analysed at 1mM. This concentration will overload the system, resulting in one large peak which cannot be resolved.

The solution for running anions should be diluted to 100 µM with deionised water. The electropherogram is shown in Figure 6. Peakmaster software predicts the two positive peaks obtained, where the HSO4- and NO3- peaks cannot be resolved. Separating the anions under these conditions will not produce an EOF peak, because the EOF travels away from the detector, towards Reservoir 2.

Figure 5. Anions overloading at 1 mM concentration
Figure 6. Anions at 100 µM concentration

Procedure for Changing the Sample

  1. Disarm the HVS.
  2. Remove the cover plate from the platform.
  3. Remove the sample from the sample reservoir using a pipette.
  4. Flush the sample reservoir a few times using deionised water.
  5. Pipette 50 µL of the new sample into the sample reservoir.
  6. Replace the cover plate.
  7. Arm the HVS.
  8. Begin the analysis of the new sample.

Procedure for Removing the Microchip

  1. Disarm the HVS.
  2. Remove the cover plate from the platform.
  3. Remove the solution from each of the reservoirs using a pipette.
  4. To prevent formation of salt crystals inside the channel during storage, pipette deionised water into each of the reservoirs.
  5. Flush the microchip by placing the syringe into the Reservoir 4 and gently pressing on the syringe, holding the pressure for ten seconds.
  6. Remove the deionised water from each of the reservoirs using a pipette.
  7. Remove the reservoir cover and dry the o-rings underneath the cover using a tissue.
  8. Remove the chip.

Notes

It is sometimes necessary to filter the BGE and sample solutions to prevent particles from blocking the narrow channel of the chip. This can be achieved by using a filter which fits onto the end of the syringe.

It may also be necessary to place the BGE and sample solutions in an ultra-sonic bath to remove any dissolved air in the solutions. Dissolved air can cause the formation of air bubbles in the channel, which can result in an electric arc when the high voltage is applied. This produces high temperatures in the channel which can damage the channel of the chip.

Observing the current flowing through the channel of the chip can be useful when developing a method. This current is displayed in the Sequencer software, and it can be recorded from the monitor connectors at the back of the HVS. If the current reads zero, or is very noisy, during the separation step, this suggests there is an air bubble in channel.

If the channel of the chip becomes blocked with particles, it may be possible to clear the obstruction, either by injecting air into one end of the channel using a syringe, or by using a weak vacuum at one end of the channel. Use a lint-free tissues, as opposed to normal tissues, to prevent particles from blocking the channel of the chip.

If the sample peaks get progressively smaller over successive runs, this may be due to the depletion of ions in the sample reservoir close to the start of the channel. You can mix the sample in the reservoir, by using a pipette to suck the sample in and out of the pipette a few times.

If the baseline begins to drift a lot during the analysis, it may be useful to flush the chip using the syringe. Place the syringe into the outlet reservoir and gently press on the syringe and hold the pressure for ten seconds.

You may have to the alter the Offset and change the Range several times during a series of runs, but do NOT alter the Frequency, Amplitude or Headstage Gain settings until you have completed all the calibration and sample runs in an experiment.

Cleaning and Storing the Chip

The chip can be rinsed and emptied while it is still in the Chip Platform. This is done by pushing the nozzle of a syringe into the sloping reservoir holes of the reservoir cover and gently pushing on the plunger to apply pressure.

Alternatively, this can be done with the chip removed from the Chip Platform, by using a syringe with a rubber O-ring connected to its nozzle. To make this device, cut most of the nozzle from a syringe and glue a rubber O-ring to the end of the syringe. The O-ring is then pushed down onto the glass surface of the chip above the reservoir. The plunger is gently pushed to force liquid or air through the channel of the chip.

For the optimum performance, the chip should be properly treated after use to clean the glass surface and restore the EOF properties. Please follow the instructions provided by the chip manufacturer.

Gated Injection

Introduction

The previous experiment described a Floating Injection, where the reservoirs at the ends of the long separating channel (Reservoirs 2 and 4) are disconnected from the High Voltage Sequencer during the sample injection step. An alternative type of injection, called a Gated Injection, may also be used. A Gated Injection requires two units of the ER230 High Voltage Sequencer, as the voltages at all four reservoirs need to be controlled.

Procedure

Table 4. Connecting Chip Platform to HVS for a Gated Injection

The hardware should be setup as described for the Floating Injection, except the Chip Platform should be connected to the HVS as shown in Table 4.

In the Sequencer software, setup a sequence as shown in Table 5 for cations. For the separation of anions, the polarities of the applied voltages are reverse (set all the voltages in Table 5 to negative values).

In the sequence, make sure that you enter the trigger command for the correct HVS. For example, if you have connected the trigger cable to the Master HVS hardware, make sure you enter the “High/Closed” command in the Digital Out column for the Master HVS.

The sample should be diluted to 100 µM with deionised water. Pipette 50 µL of BGE into Reservoir 4, 3 and 1, and 50 µL of sample into Reservoir 2.

Follow the rest of the instructions to start the PowerChrom and Sequencer softwares.

Table 5. Sequence for separating cations using a Gated Injection
Figure 7. Flow during Initial/Separation Step
Figure 8. Flow during Injection Step

Flow of Sample and BGE

During the initial/separation step (shown in Figure 7) there is a constant flow of sample from Reservoir 2 to Reservoir 1, while the BGE flows from Reservoir 3 to Reservoir 4. There is also flow of BGE from Reservoir 3 to Reservoir 1, which keeps the sample out of the separation channel.

After 45 seconds, the injection step occurs (shown in Figure 8). The voltage at Reservoir 3 is reduced, from 1000V to 4000V, for a fraction of a second. This allows a plug of sample into the separation channel.

When the voltage at Reservoir 3 is restored to its original value, the sample plug is broken off and separated as it flows towards Reservoir 4 and the detector.

Notes for Gated Injections

The amount of sample injected is a function of the length of time of the injection. The formation of the sample plug injected into the separation channel is a combination of electromigration and EOF (if the EOF is in the same direction as the electromigration). This type of injection may produce an electrokinetic bias: faster migrating compounds are introduced into the separation channel in a greater quantity than slower migrating compounds.

Contamination in the chip can reduce the surface charge on the surface of the channel. This explains why the EOF peak may be smaller, or may not be seen at all, when using a chip had been used many times.