Difference between revisions of "テザードメンブレン"

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[[File:tethaPlate6.png|400px|thumb|right|'''Figure 2.''' tethaPlate]]
 
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テーザードメンブレンは金電極の表面に [http://en.wikipedia.org/wiki/Lipid_bilayer リン脂質二重層] をサポートする平坦膜で、一対の疎水性 [http://en.wikipedia.org/wiki/Polyethylene_glycol ポリエチレングリコール] (PEG) 鎖がアンカーと呼ばれる[http://en.wikipedia.org/wiki/Category:Organic_disulfides 有機ジスルフィド] によって金表面に共有結合しています（図 1 参照）。親油性のアルカン [http://en.wikipedia.org/wiki/Phytane フィタル基]がPEG鎖の上部で結合し、それが骨格として働き周辺の脂質膜をクラスター化させ、強いては連続膜を形成するまでになります。
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テーザードメンブレンは金電極の表面に [http://en.wikipedia.org/wiki/Lipid_bilayer リン脂質二重層] をサポートする平坦膜で、一対の疎水性 [http://en.wikipedia.org/wiki/Polyethylene_glycol ポリエチレングリコール] (PEG) 鎖がアンカーと呼ばれる[http://en.wikipedia.org/wiki/Category:Organic_disulfides 有機ジスルフィド] によって金表面に共有結合しています（図 1 参照）。親油性のアルカン [http://en.wikipedia.org/wiki/Phytane フィタル基]がPEG鎖の上部で結合し、それが骨格として働き周辺の脂質膜をクラスター化させ、強いては連鎖して膜を形成するまでになります。
  
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PEG鎖のジスルフィドアンカーと共に、[http://en.wikipedia.org/wiki/Phytane フィタル基] も膜を金表面に結合させるので[http://en.wikipedia.org/wiki/Tether テザー] 分子と呼ばれます。実際には、金基質上でテザー同士はスペーサと呼ばれる親油性の [http://en.wikipedia.org/wiki/Phytane フィタニル基]の無い類似の分子を介して離れています。これらのスペーサは膜の下にあり、直接膜には接していません。金基質表面はテザーとスペーサとで被覆されますが、 両者がくっつくことは無く、大きな有機ジスルフィドアンカー基を挟んで離れています。
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PEG鎖のジスルフィドアンカーと共に、[http://en.wikipedia.org/wiki/Phytane フィタル基] も膜を金表面に結合させるので[http://en.wikipedia.org/wiki/Tether テザー] 分子と呼ばれます。 実際には金基質上でテザー同士はスペーサと呼ばれる親油性の [http://en.wikipedia.org/wiki/Phytane フィタニル基]の無い類似の分子を介して離れています。これらのスペーサは膜の下にあって、直接膜には接していません。金基質表面はテザーとスペーサとで被覆されますが、 両者がくっつくことは無く、大きな有機ジスルフィド基のアンカーを挟んで離れています。
  
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テザーとスペースとの平均間隔は約4 nm (およそ水分子9個分) で、金表面上の膜の厚さは約40 nm (但し、0.5 nm は有機ジスルフィド基アンカが占めています）です。
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テザーとスペースとの平均間隔は約4 nm (およそ水分子9個分)で、金表面上の膜の厚さは約40 nm (但し、0.5 nmは有機ジスルフィドアンカが占めています）です。
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従って膜と金表面間のスペースはPEG鎖、ジスルフィドアンカ群、様々なカチオンやアニオン、及び水分子の混合体で、これを総じてtethaPlasm™と呼んでいます。　これは生きた細胞の[http://en.wikipedia.org/wiki/Cytoplasm サイトプラズマ] （細胞質）に相当し、サイトプラズマのようにバルク水とは若干異なる特性を示します。
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従って膜と金表面間のスペースはPEG鎖、ジスルフィド基アンカ群、様々なカチオンやアニオン、及び水分子の混合体で、これを総じて tethaPlasm™ と呼んでいます。これは生きた細胞の [http://en.wikipedia.org/wiki/Cytoplasm サイトプラズマ] （細胞質）に相当し、サイトプラズマのようにバルク水とは若干異なる特性を示します。
  
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一定のバイアス電圧を用いて剰余カチオンやアニオンを有するこの tehaPlasm を'チャージ'して、tethaPatch や tehaPod の測定に利用します (下記参照)。
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一定のバイアス電圧を用いて剰余カチオンやアニオンを有するこの tehaPlasm を'チャージ'し、tethaPatch や tehaPod の測定に活用します (下記参照)。
  
 
=== '''テザードメンブレンはタフです！''' ===
 
=== '''テザードメンブレンはタフです！''' ===
 
テザーとスペーサとの混合比は製造過程で異なります。標準のtethaPlate™ は膜の安定性や柔軟性が最も高いとされる1:10の割合で提供されています。 高い柔軟性が求められる場合は 1:100 程度の割合まで使えますが、これ以下では膜の品質が損なわれ推奨できません。逆に100%まで上げると、安定性が最大限得られます。  
 
テザーとスペーサとの混合比は製造過程で異なります。標準のtethaPlate™ は膜の安定性や柔軟性が最も高いとされる1:10の割合で提供されています。 高い柔軟性が求められる場合は 1:100 程度の割合まで使えますが、これ以下では膜の品質が損なわれ推奨できません。逆に100%まで上げると、安定性が最大限得られます。  
  
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混合比 10% の標準のテザードンブレンは極めて頑丈で、調整後数ケ月のライフタイムを持っています(4°C で保存すること)。膜は電気パルスに対しても極めて強く -500 ～ +800 mV の範囲の電位にも強い耐性を示しますので、従来のホールセルクランプの測定に用いられる以上の電圧をかけることも可能です。
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混合比 10% の標準のテザードメンブレンは極めて頑丈で、調整後数ケ月のライフタイムがあります(4°C で保存すること)。膜は電気パルスに対しても極めて強く -500 ～ +800 mV の範囲の電位にも強い耐性を示しますので、従来のホールセルクランプの測定に用いられる以上の電圧をかけることが可能です。
  
 
== '''tethaPlate™''' ==
 
== '''tethaPlate™''' ==
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[http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=SDx-T10 tethaPlate™] は金電極　(3.0 x 0.7 mm = 2.1 mm<sup>2</sup>) を含む６つの各チャンバーから成り、金電極表面はテザーとスペーサ分子とで被覆処理されています。適切なリン脂質ミクスチャーを加えると自発的に膜を形成します。ついで未処理の金カウンター電極を膜の上 0.15 mm　にセットしますが、膜には接触させません。
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[http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=SDx-T10 tethaPlate™] は金電極　(3.0 x 0.7 mm = 2.1 mm<sup>2</sup>) を含む６つの各チャンバーから成り、金電極表面はテザーとスペーサ分子とで被覆処理されています。適正なリン脂質ミクスチャーを加えると自発的に膜を形成します。ついで未処理の金カウンター電極を膜の上 0.15 mm　にセットしますが、膜には接触させません。
  
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tethaPlate は極めて頑丈なハウジングなので、通常のイオンチャネル標本が数日程度しか保存できないのに比べて、シンプルなリン脂質で調整したテザーﾄﾞ膜なら 4℃で数週間は安定して保存できます！
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tethaPlate は極めて頑丈なハウジングなので、通常のイオンチャネル標本が数日程度しか保存できないのに比べて、シンプルなリン脂質で調整したテザーﾄﾞ膜なら 4℃で数週間は安定して保存ができます！
  
 
tethaPlate の取り付け方とテザードメンブレンの調整法は Video 1 と 2　をご覧ください。
 
tethaPlate の取り付け方とテザードメンブレンの調整法は Video 1 と 2　をご覧ください。
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== '''膜タンパク'''==
 
== '''膜タンパク'''==
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[[File:Ionchannels1.png|400px|thumb|right|'''Figure 3.''' イオンチャネルタンパク([http://en.wikipedia.org/wiki/Mechanosensitive_channels MscL. 左, と MscS]) はテザードメンブレンにスケールされています。このタンパクの配向性に留意し、その上部が tethaPlasm　の外側に収納された構造になってるのが確認できます。]]
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[[File:Ionchannels1.png|400px|thumb|right|'''図 3.''' イオンチャネルタンパク([http://en.wikipedia.org/wiki/Mechanosensitive_channels MscL. 左, と MscS]) がテザードメンブレン内にスケールされています。このタンパクの配向性に留意します。その上部が tethaPlasm　の外側に収納されているのが確認できます。]]
  
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多くのタンパクは親油性部位と親水性部位から構成されており、こらがタンパクの三次構造[http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_tertiary_structure (tertiary protein structure)]に関与しています。 親油性部位はかなりの頻度で細胞や細胞小器官、膜と結合していますので、これらのタンパクは膜タンパク[http://en.wikipedia.org/wiki/Membrane_protein (membrane proteins)] と呼ばれます。
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多くのタンパクは親油性部位と親水性部位から構成されており、これらがタンパクの三次構造[http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_tertiary_structure (tertiary protein structure)]　に関与しています。 親油性部位はかなりの頻度で細胞や細胞小器官、膜と結合していますので、これらのタンパクは膜タンパク[http://en.wikipedia.org/wiki/Membrane_protein (membrane proteins)] と呼ばれます。
  
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A special class of membrane protein is designed to facilitate the transport of cations or anions across the otherwise impermeable lipophilic cell membrane. Such proteins are known as [http://en.wikipedia.org/wiki/Ion_channel ion channels].
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ある種の膜タンパクは、比較的透過性のある親油性の細胞膜を通るカチオンやアニオンの輸送を促進します。このようなタンパクを [http://en.wikipedia.org/wiki/Ion_channel イオンチャネル]　と呼びます。
  
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The tether/spacer ratio of a tethered membrane dictates the maximum size of protein that can be housed. The standard 1:10 ratio has been found suitable for hosting protein structures up to 40000 Da (ie that part of the protein actually within the membrane) and these individual proteins may then assemble into oligomeric pore structures - which is often the final form of the ion channel in the membrane.
 
  
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Note that even the small ion channel polypeptides, such as [http://en.wikipedia.org/wiki/Gramicidin gramicidin] (1882 Da) and [http://en.wikipedia.org/wiki/Valinomycin valinomycin] (1111 Da), are equally well accommodated in tethered membranes.
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テザードメンブレンのテザー/スペーサの混合比で、取り込めるタンパクの大きさが決まります。標準的な1:10の混合比では40,000 Da (言い換えれば、膜内の実際のタンパク部分)までのタンパクを取り込むのに適しているとされ、個々のタンパクはオリゴマーのポア構造に組み込まれ、最終的に一部は膜内でイオンチャンネルを形成します。
  
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Larger ion channels, such as those shown in Figure 3, often have  'superstructures' that extend into the aqueous solution adjacent to the membrane. Even a moderately sized superstructure cannot be accommodated inside the crowded tethaPlasm forcing the membrane protein to adopt a preferred oriention (as often happens in a living cell).
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グラミジン [http://en.wikipedia.org/wiki/Gramicidin gramicidin] (1882 Da) やバリノマイシン [http://en.wikipedia.org/wiki/Valinomycin valinomycin] (1111 Da),などの最も小さいイオンチャネルのポリペプチドなどは、テザードメンブレンの中に均一に配位されます。
  
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== Ion Channels ==
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図 3 に示すような大きなイオンチャネルでは、上部（'superstructures'）がメンブレン近傍の水溶液の中まで伸びています。中位のサイズのタンパクでさえ、その 'superstructures' が tethaPlasm の中に納まることは稀で、（生きた細胞で見られるように）膜タンパクは好ましい配位を取ります。
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Low molecular weight polypeptide ionophores and ion channels (such as gramicidin, valinomycin, magainin, alamethicin, and ionomycin) are available commercially in pure form. Larger proteins may be commercially available supplied in a detergent or lipid matrix. However most larger proteins must be custom made using bacterial culture, using [http://en.wikipedia.org/wiki/Genomics genomic] techniques either in-house or by a contract biotechnology company.
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== '''イオンチャネル''' ==
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Typically the culture bacteria have the appropriate gene or RNA fragment artificially inserted into them so that they over express the desired ion channel protein. After several days of incubation the bacteria are harvested and the protein components separated and purified (often by gel electrophoresis).
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低分子量のポリペプチドイオノフォアやイオンチャネル（グラミシジン、バリノマイシン、アラメチシン、マガイニンやイオノマイシンなど）は純正品が市販されています。デタージェントや脂質マトリックスとして販売されているタンパクもあります。大きな分子量のタンパクで供給されているものの多くは、バクテリア培養や [http://en.wikipedia.org/wiki/Genomics 遺伝子] 技術を使ったカスタムメイドで、生命工学研究室や企業から供給されています。
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Whereas this was cutting edge technology in the 1990's these techniques are now well developed and widely available in [http://en.wikipedia.org/wiki/Proteomics proteomics] laboratories.
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通常バクテリア培養では該当遺伝子やRNAフラグメントを人工的にバクテリアに組み込ませ、必要なイオンチャネルタンパクを発現させます。数日培養した後、バクテリアをハーベスタ処理してタンパク化合物を分離精製（ゲル電気泳動などで）します。
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これらは1990年代に開発された最先端技術で、
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[http://en.wikipedia.org/wiki/Proteomics プロテオミクス] 研究室では盛んに活用されています。
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ヒトのゲノムでは、約400種類のイオンチャネルがコード化されていると考えられていますが、まだその一部しか詳しく研究されていません。なかでも－ ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩素（などの陰イオン）－ は今日的な研究対象となっています。イオンチャネルは多様性が高いので、各組織内で様々な活性モードを担っています。 例えば神経細胞内では、様々なカリウムイオンチャネルが [http://en.wikipedia.org/wiki/Action_potential アクションポテンシャル] の伝播、心拍リズム、圧変動に対する細胞の反応 ([http://en.wikipedia.org/wiki/Mechanosensitive_ion_channel （機械刺激依存性イオンチャネル）]) に関与しています。
  
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The human genome itself is believed to code for about 400 different types of ion channel, and only a fraction of these have as yet been studied in detail. However, only a handful of ions - sodium potassium, calcium, magnesium, hydrogen, chloride (and other anions) - are relevant to the study of ion channels. The large variety of ion channels is required for different types of activity in different tissues. For example different potassium ion channels can be involved in [http://en.wikipedia.org/wiki/Action_potential action potential] propagation in neve cells, the regulation of cardiac rythm, the response of cells to pressure changes ([http://en.wikipedia.org/wiki/Mechanosensitive_ion_channel mechano-sensitive ion channels]).
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類似のイオンチャネルは別の器官でも生じますが、種によっては構造を変化させ適正な機能を確保しています。
  
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Similar ion channels occur in different organisms, however the structure is often slightly altered to optimise function as required by the species concerned.
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== '''イオノフォア''' ==
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[[File:patchclamp1.png|400px|thumb|right|'''図 4.''' 従来のパチクランプ法　http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp]]
  
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== Ionophores ==
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天然物 (例えば[http://en.wikipedia.org/wiki/Ionomycin ionomycin] や [http://en.wikipedia.org/wiki/A23187 calicimycin])でも人工的な [http://en.wikipedia.org/wiki/Ionophore イオノフォア] (例[http://en.wikipedia.org/wiki/Crown_ether crown ethers], [http://en.wikipedia.org/wiki/Calixarene calixeranes], [http://en.wikipedia.org/wiki/Cryptand cryptands] などの [http://en.wikipedia.org/wiki/Synthetic_ion_channels 合成イオンチャネル]) 研究にもテザードメンブレンが活用できます。 イオノフォアは必ずしもポリペプチドだけではなく極めて小さな分子のものもありますが、少なくとも部分的には脂溶性で膜の内に取り込むことができます。多くのイオノフォアが抗生物質や家畜の成長促進物質、イオンセンサーとして[http://wiki.edaq.com/index.php/Ionophores_in_Society applications]で紹介されています。
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[[File:patchclamp1.png|400px|thumb|right|'''Figure 4.''' A classic patch clamp experiment http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp]]
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Both natural (such as [http://en.wikipedia.org/wiki/Ionomycin ionomycin] and [http://en.wikipedia.org/wiki/A23187 calicimycin]), and artificial [http://en.wikipedia.org/wiki/Ionophore ionophores] (such as [http://en.wikipedia.org/wiki/Crown_ether crown ethers], [http://en.wikipedia.org/wiki/Calixarene calixeranes], [http://en.wikipedia.org/wiki/Cryptand cryptands] and other [http://en.wikipedia.org/wiki/Synthetic_ion_channels synthetic ion channels]) can also be studied with tethered membrane systems. Ionophores are not always polypeptides and may be quite small molecules, however they must be at  least partially lipohilic to ensure they can enter the membrane. Several ionophores have found [http://wiki.edaq.com/index.php/Ionophores_in_Society applications] as antibiotics, livestock growth promoters, and ion sensors.
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== '''従来のパッチクランプ法''' ==
  
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== Classic Patch Clamping ==
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従来の [http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp パッチクランプ法] の実験では、マイクロピペット電極を使って細胞膜を捉え、単一または数個のイオンチャネルを記録します。通常は長時間試行錯誤しながら所定のポジションに電極を誘導する必要があります。標準的なイオンのカレントシグナルは極めて小さく （数ピコアンペア） 、良好なS/N比のシグナルを得るにはかなりの技能を要します。
  
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The classic [http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp patch clamp] experiment uses a micropipette electrode that is positioned against a cell membrane to cover just one, or a few, ion channels. Usually a prolonged trial and error process is required to get the electrode in the right position. The ion current signal is normally very small (a few picoamperes) and great care must be take to achieve good signal/noise levels.
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パッチクランプから派生したホールセルクランプやオーサイトクランプ法では、多くのイオンチャネルを連続的に記録できます。この場合は大きいシグナル (かつ低ノイズ) で記録できますが、様々なタイプのイオンチャネルが存在しますので条件が複雑になるという難点もあります。
  
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Variants of the technique include whole cell and oocyte patch clamping where the signals from many ion channels can be recorded simultaneously. This gives a larger (and quieter) signal but may be complicated by there being several types of ion channel present.
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近年、オートパッチクランプ装置が開発され発売されていますが、技術的には従来の方法を踏襲したもので、再現性のあるシグナルを得るのに難点であったマイクロピペット電極のポジショニングの問題が完全には解決されておりません。
  
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In recent years automated patch clamps have entered the market but the technique is still hampered by the difficulty of positioning a micropipette electrode to get reproducible signals.
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== '''ゲノム/プロテオーム革命'''==
  
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== Genomics/Proteomics Revolution ==
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上述のように、21世紀初頭には [http://en.wikipedia.org/wiki/Genomics ゲノム] や [http://en.wikipedia.org/wiki/Proteomics プロテオミクス] 技術の急激な進歩によって、イオンチャンネルタンパクの分離、定量分析が可能になりました。この技術は大学をはじめ様々な研究施設、製薬企業の研究室や病院の研究部門などに急速に広まりました。
  
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As mentioned above, the first years of the 21st century saw the raphid development of [http://en.wikipedia.org/wiki/Genomics genomics] and [http://en.wikipedia.org/wiki/Proteomics proteomics] techniques so that it is now possible to isolate quantities of a single type of ion channel protein. This technology is now widespread in universities, research institutes, pharmaceutical company labs and hospital research departments.
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まず精製したシングルタイプイオンチャネルの定量分析のルーチン化が可能になります。研究者にとって煩雑なイオンチャネルの細孔をパッチ記録する作業からも開放されます。
  
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For the first time studies can now be done on a 'routine' basis with reasonable quantities of pure protein giving a single type of ion channel. No longer are researchers restricted to making patches where only one or a several ion channel pores are being monitored.
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[[File:tethaPatchER466.png|400px|thumb|right|'''図 5.''' tethaPatch ユニットと ER466 ポテンショスタットを使います。]]
  
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[[File:tethaPatchER466.png|400px|thumb|right|'''Figure 5.''' A tethaPatch unit sitting on an ER466 Potentiostat]]
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== [http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=SDx-R2 '''tethaPatch'''™] ==
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== The [http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=SDx-R2 tethaPatch™] ==
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人工テザードメンブレンのパッチ部位(面積0.21 ㎜2) にシングルタイプのイオンチャネルタンパクをアッセンブリすることで、１～100万個単位のチャネルを同時に測定します。この方法ではパッチ内の全イオンチャネルの総イオン電流を測定することになり、マイクロアンペア単位のシグナルを低いノイズレベルで測定できます。イオンチャネルは自発的にテザードメンブレン内に取り込まれ作用電極ともつながってますので、マイクロピペット電極を試行錯誤しながらパッチする煩雑な作業から開放されます。
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By assembling a single type of ion channel protein in a large patch (2.1 mm2 area) of artificial tethered membrane membrane somewhere between 1 and 10 million channels can be studied in parallel. The measured ion current  is the sum total from all the ion channels in the patch, so that signals in the microampere ranges are obtained with concomitantly low noise levels. Because the ion channels  spontaneously house themselves in the tethered membrane which is already bonded to the working electrode there is no 'hit-or-miss' approach with a micropipette electrode.
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tethaPatch™ techniques, while analogous to [http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp#Whole-cell_recording_or_whole-cell_patch whole cell patch clamping], typically provide results in minutes that would otherwise take hours with conventional techniques. Also because the tethered membranes are very robust, voltage pulses can be applied that would otherwise 'blow' the seal of a traditional patch clamp preparation. Thus voltage-gated, and mechanosensitive ion channels, can now be studied over a wide range of pulse amplitudes (potentials between -500 to +800 mV can be applied)  than previously achievable (typically less than ±300 mV), leading to new insights into the mechanism of ion channel behaviour.
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tethaPatch™ 技術はホールセルパッチクランプ法と似ていますが、従来法が測定に数時間要するのに比べて分単位で測定できます。 また、テザードメンブレンは丈夫なのでかなりの電圧パルスが導入できます。従来のパッチクランプではシールが "blow"するので容易ではありませんでした。従って従来法に比べ（±300 mV程度）、電位依存性及び機械刺激依存性イオンチャネルを幅広いパルスアンプリチュード（-500～+800mV の高範囲の印加電圧が可能）で測定できます。
  
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The [http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=ER466 ER466 Integrated Potentiostat] is suitable for use with the tethaPatch, Figure 6, for pulse generation and data acquisition of the current signal.
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tethaPatch の測定には [http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=ER466 ER466 ポテンショスタットデータシステム] を併用します。 図 6 は発生パルスと収録するシグナルの表示です。
  
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[[File:tethaPod1.png|400px|thumb|right|'''Figure 6.''' A tethaPod unit with its software in the background]]
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[[File:tethaPod1.png|400px|thumb|right|'''図 6.''' tethaPod ユニットと背景はそのソフトウェア]]
  
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== The [http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=SDx-R1 tethaPod™] ==
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== [http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=SDx-R1 '''tethaPod'''™] ==
  
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tethaPod techniques take advantage of the relatively large signals provided by a tethered membrane system. By applying a small amplitude (20 mV) AC signal of varying frequency to the electrodes of a tethaPlate™, the membrane conductivity and capacitance can be directly determined. This is particularly relevant for pharmaceutical studies where continuous monitoring of membrane conductance can be done while various concentrations of ion channel blocker or actuator are added to the [http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=SDx-T10 tethaPlate™]. The results can then be analysed by [http://en.wikipedia.org/wiki/Dose–response_relationship dose/response] methods enabling rapid screening of potential drug candidates.
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tethaPod では、テザードメンブレンシステムを比較的大きいシグナルで扱うことができるという利点があります。tethaPlate™ の電極に振幅の小さい(20 mV) ACシグナルを周波数を変えて掛けることで、膜のコンダクタンスとキャパシタンスが直接測定できます。これは医薬品の研究開発には重要な分析テーマで、膜のコンダクタンスを連続的にモニターし、しかも [http://www.edaq.com/product_details_page.php?product_no=SDx-T10 tethaPlate™]　では濃度の異なるイオンチャネルブロッカーやアクチエータを添加して分析ができます。測定結果を[http://en.wikipedia.org/wiki/Dose–response_relationship ドーズレスポンス] として解析すれば、新薬候補の迅速なスクリーニング法として活用することもできます。
  
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== References ==
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== '''参考文献''' ==
 
# Comparative Study of the Bacterial Sodium Channel NaChBac Function using Patch Clamp and A.C. Impedance Spectroscopy in a Tethered Membrane. Bruce A. Cornell, Gwenael Scolan, Andrew M. Powl, Sonia Carne, Bonnie A. Wallace, Biophysical Journal, 102, 3, 338a, 2012. [http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2011.11.1852 DOI: 10.1016/j.bpj.2011.11.1852]
 
# Comparative Study of the Bacterial Sodium Channel NaChBac Function using Patch Clamp and A.C. Impedance Spectroscopy in a Tethered Membrane. Bruce A. Cornell, Gwenael Scolan, Andrew M. Powl, Sonia Carne, Bonnie A. Wallace, Biophysical Journal, 102, 3, 338a, 2012. [http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2011.11.1852 DOI: 10.1016/j.bpj.2011.11.1852]
 
# The protective effect of osmoprotectant TMAO on bacterial mechanosensitive channels of small conductance MscS/MscK under high hydrostatic pressure.  Evgeny Petrov, Paul R. Rohde, Bruce Cornell, and Boris Martinac. Channels, 6:4, 1-10, 2012. [http://dx.doi.org/10.4161/chan.20833  DOI: 10.4161/chan.20833]
 
# The protective effect of osmoprotectant TMAO on bacterial mechanosensitive channels of small conductance MscS/MscK under high hydrostatic pressure.  Evgeny Petrov, Paul R. Rohde, Bruce Cornell, and Boris Martinac. Channels, 6:4, 1-10, 2012. [http://dx.doi.org/10.4161/chan.20833  DOI: 10.4161/chan.20833]
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Trademarks: tethaPod, tethaPatch, tethaPlate, and tethaPlasm are trademarks of [http://www.sdxtetheredmembranes.com SDx Tethered Membranes Pty Ltd.]
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商標: tethaPod, tethaPatch, tethaPlate, 及び tethaPlasm は[http://www.sdxtetheredmembranes.com SDx Tethered Membranes Pty Ltd.] 　の商標です。

Latest revision as of 18:42, 28 May 2014

テザードメンブレンとは?

図 1. テザードメンブレンの構造
Figure 2. tethaPlate

テーザードメンブレンは金電極の表面に リン脂質二重層 をサポートする平坦膜で、一対の疎水性 ポリエチレングリコール (PEG) 鎖がアンカーと呼ばれる有機ジスルフィド によって金表面に共有結合しています（図 1 参照）。親油性のアルカン フィタル基がPEG鎖の上部で結合し、それが骨格として働き周辺の脂質膜をクラスター化させ、強いては連鎖して膜を形成するまでになります。

PEG鎖のジスルフィドアンカーと共に、フィタル基 も膜を金表面に結合させるのでテザー 分子と呼ばれます。 実際には金基質上でテザー同士はスペーサと呼ばれる親油性の フィタニル基の無い類似の分子を介して離れています。これらのスペーサは膜の下にあって、直接膜には接していません。金基質表面はテザーとスペーサとで被覆されますが、 両者がくっつくことは無く、大きな有機ジスルフィド基のアンカーを挟んで離れています。

テザーとスペースとの平均間隔は約4 nm (およそ水分子9個分) で、金表面上の膜の厚さは約40 nm (但し、0.5 nm は有機ジスルフィド基アンカが占めています）です。

従って膜と金表面間のスペースはPEG鎖、ジスルフィド基アンカ群、様々なカチオンやアニオン、及び水分子の混合体で、これを総じて tethaPlasm™ と呼んでいます。これは生きた細胞の サイトプラズマ （細胞質）に相当し、サイトプラズマのようにバルク水とは若干異なる特性を示します。

一定のバイアス電圧を用いて剰余カチオンやアニオンを有するこの tehaPlasm を'チャージ'し、tethaPatch や tehaPod の測定に活用します (下記参照)。

テザードメンブレンはタフです！

テザーとスペーサとの混合比は製造過程で異なります。標準のtethaPlate™ は膜の安定性や柔軟性が最も高いとされる1:10の割合で提供されています。 高い柔軟性が求められる場合は 1:100 程度の割合まで使えますが、これ以下では膜の品質が損なわれ推奨できません。逆に100%まで上げると、安定性が最大限得られます。

混合比 10% の標準のテザードメンブレンは極めて頑丈で、調整後数ケ月のライフタイムがあります(4°C で保存すること)。膜は電気パルスに対しても極めて強く -500 ～ +800 mV の範囲の電位にも強い耐性を示しますので、従来のホールセルクランプの測定に用いられる以上の電圧をかけることが可能です。

tethaPlate™

tethaPlate™ は金電極　(3.0 x 0.7 mm = 2.1 mm2) を含む６つの各チャンバーから成り、金電極表面はテザーとスペーサ分子とで被覆処理されています。適正なリン脂質ミクスチャーを加えると自発的に膜を形成します。ついで未処理の金カウンター電極を膜の上 0.15 mm　にセットしますが、膜には接触させません。

tethaPlate は極めて頑丈なハウジングなので、通常のイオンチャネル標本が数日程度しか保存できないのに比べて、シンプルなリン脂質で調整したテザーﾄﾞ膜なら 4℃で数週間は安定して保存ができます！

tethaPlate の取り付け方とテザードメンブレンの調整法は Video 1 と 2　をご覧ください。

Video 1. tethaPlate カートリッジの取り付け方
Video 2. テザードメンブレンの調整法

膜タンパク

図 3. イオンチャネルタンパク(MscL. 左, と MscS) がテザードメンブレン内にスケールされています。このタンパクの配向性に留意します。その上部が tethaPlasm　の外側に収納されているのが確認できます。

多くのタンパクは親油性部位と親水性部位から構成されており、これらがタンパクの三次構造(tertiary protein structure)　に関与しています。 親油性部位はかなりの頻度で細胞や細胞小器官、膜と結合していますので、これらのタンパクは膜タンパク(membrane proteins) と呼ばれます。

ある種の膜タンパクは、比較的透過性のある親油性の細胞膜を通るカチオンやアニオンの輸送を促進します。このようなタンパクを イオンチャネル　と呼びます。


テザードメンブレンのテザー/スペーサの混合比で、取り込めるタンパクの大きさが決まります。標準的な1:10の混合比では40,000 Da (言い換えれば、膜内の実際のタンパク部分)までのタンパクを取り込むのに適しているとされ、個々のタンパクはオリゴマーのポア構造に組み込まれ、最終的に一部は膜内でイオンチャンネルを形成します。

グラミジン gramicidin (1882 Da) やバリノマイシン valinomycin (1111 Da),などの最も小さいイオンチャネルのポリペプチドなどは、テザードメンブレンの中に均一に配位されます。

図 3 に示すような大きなイオンチャネルでは、上部（'superstructures'）がメンブレン近傍の水溶液の中まで伸びています。中位のサイズのタンパクでさえ、その 'superstructures' が tethaPlasm の中に納まることは稀で、（生きた細胞で見られるように）膜タンパクは好ましい配位を取ります。

イオンチャネル

低分子量のポリペプチドイオノフォアやイオンチャネル（グラミシジン、バリノマイシン、アラメチシン、マガイニンやイオノマイシンなど）は純正品が市販されています。デタージェントや脂質マトリックスとして販売されているタンパクもあります。大きな分子量のタンパクで供給されているものの多くは、バクテリア培養や 遺伝子 技術を使ったカスタムメイドで、生命工学研究室や企業から供給されています。

通常バクテリア培養では該当遺伝子やRNAフラグメントを人工的にバクテリアに組み込ませ、必要なイオンチャネルタンパクを発現させます。数日培養した後、バクテリアをハーベスタ処理してタンパク化合物を分離精製（ゲル電気泳動などで）します。 これらは1990年代に開発された最先端技術で、 プロテオミクス 研究室では盛んに活用されています。

ヒトのゲノムでは、約400種類のイオンチャネルがコード化されていると考えられていますが、まだその一部しか詳しく研究されていません。なかでも－ ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩素（などの陰イオン）－ は今日的な研究対象となっています。イオンチャネルは多様性が高いので、各組織内で様々な活性モードを担っています。 例えば神経細胞内では、様々なカリウムイオンチャネルが アクションポテンシャル の伝播、心拍リズム、圧変動に対する細胞の反応 (（機械刺激依存性イオンチャネル）) に関与しています。

類似のイオンチャネルは別の器官でも生じますが、種によっては構造を変化させ適正な機能を確保しています。

イオノフォア

図 4. 従来のパチクランプ法　http://en.wikipedia.org/wiki/Patch_clamp

天然物 (例えばionomycin や calicimycin)でも人工的な イオノフォア (例crown ethers, calixeranes, cryptands などの 合成イオンチャネル) 研究にもテザードメンブレンが活用できます。 イオノフォアは必ずしもポリペプチドだけではなく極めて小さな分子のものもありますが、少なくとも部分的には脂溶性で膜の内に取り込むことができます。多くのイオノフォアが抗生物質や家畜の成長促進物質、イオンセンサーとしてapplicationsで紹介されています。

従来のパッチクランプ法

従来の パッチクランプ法 の実験では、マイクロピペット電極を使って細胞膜を捉え、単一または数個のイオンチャネルを記録します。通常は長時間試行錯誤しながら所定のポジションに電極を誘導する必要があります。標準的なイオンのカレントシグナルは極めて小さく （数ピコアンペア） 、良好なS/N比のシグナルを得るにはかなりの技能を要します。

パッチクランプから派生したホールセルクランプやオーサイトクランプ法では、多くのイオンチャネルを連続的に記録できます。この場合は大きいシグナル (かつ低ノイズ) で記録できますが、様々なタイプのイオンチャネルが存在しますので条件が複雑になるという難点もあります。

近年、オートパッチクランプ装置が開発され発売されていますが、技術的には従来の方法を踏襲したもので、再現性のあるシグナルを得るのに難点であったマイクロピペット電極のポジショニングの問題が完全には解決されておりません。

ゲノム/プロテオーム革命

上述のように、21世紀初頭には ゲノム や プロテオミクス 技術の急激な進歩によって、イオンチャンネルタンパクの分離、定量分析が可能になりました。この技術は大学をはじめ様々な研究施設、製薬企業の研究室や病院の研究部門などに急速に広まりました。

まず精製したシングルタイプイオンチャネルの定量分析のルーチン化が可能になります。研究者にとって煩雑なイオンチャネルの細孔をパッチ記録する作業からも開放されます。

図 5. tethaPatch ユニットと ER466 ポテンショスタットを使います。

tethaPatch™

人工テザードメンブレンのパッチ部位(面積0.21 ㎜2) にシングルタイプのイオンチャネルタンパクをアッセンブリすることで、１～100万個単位のチャネルを同時に測定します。この方法ではパッチ内の全イオンチャネルの総イオン電流を測定することになり、マイクロアンペア単位のシグナルを低いノイズレベルで測定できます。イオンチャネルは自発的にテザードメンブレン内に取り込まれ作用電極ともつながってますので、マイクロピペット電極を試行錯誤しながらパッチする煩雑な作業から開放されます。

tethaPatch™ 技術はホールセルパッチクランプ法と似ていますが、従来法が測定に数時間要するのに比べて分単位で測定できます。 また、テザードメンブレンは丈夫なのでかなりの電圧パルスが導入できます。従来のパッチクランプではシールが "blow"するので容易ではありませんでした。従って従来法に比べ（±300 mV程度）、電位依存性及び機械刺激依存性イオンチャネルを幅広いパルスアンプリチュード（-500～+800mV の高範囲の印加電圧が可能）で測定できます。

tethaPatch の測定には ER466 ポテンショスタットデータシステム を併用します。 図 6 は発生パルスと収録するシグナルの表示です。

図 6. tethaPod ユニットと背景はそのソフトウェア

tethaPod™

tethaPod では、テザードメンブレンシステムを比較的大きいシグナルで扱うことができるという利点があります。tethaPlate™ の電極に振幅の小さい(20 mV) ACシグナルを周波数を変えて掛けることで、膜のコンダクタンスとキャパシタンスが直接測定できます。これは医薬品の研究開発には重要な分析テーマで、膜のコンダクタンスを連続的にモニターし、しかも tethaPlate™　では濃度の異なるイオンチャネルブロッカーやアクチエータを添加して分析ができます。測定結果をドーズレスポンス として解析すれば、新薬候補の迅速なスクリーニング法として活用することもできます。

参考文献

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商標: tethaPod, tethaPatch, tethaPlate, 及び tethaPlasm はSDx Tethered Membranes Pty Ltd. 　の商標です。

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